Grunnleggende tips for kryokonservering av cellekulturer

Grunnleggende tips for kryokonservering av cellekulturer

Celler fortsetter sin metabolisme under normal vekstaktivitet, noe som krever deltakelse av forskjellige proteaser. Når temperaturen synker under -70 ° C, slutter proteaser å fungere. Derfor, i et miljø med ekstremt lave temperaturer, kan celler stoppe sine metabolske aktiviteter og gå inn i en sovende tilstand som tillater langvarig lagring.

1. Eksperimentelle materialer

Basismateriale:

Grunnleggende kulturmedium

Serum (konvensjonell FBS/NBS)

Ultrapure Workbench

Sterilt dimetylsulfoksyd (DMSO)

Steril PBS fosfatbuffersaltoppløsning

Pipettering pistol

Elektrisk pipettering pistol

Utarbeidelse av eksperimentene

a) Forberedelse av fryseløsningen:

Generelle celler: 55% basalt medium + 40% bovint serum (FBS/NBS) + 5% DMSO

Vitale celler: 90% bovint serum (FBS/NBS) + 10% DMSO

Aliquot den tilberedte kryokonserveringsløsningen i et 15 ml sentrifugerør [reir] og lagre ved 4 ° C for senere bruk.

(b) Fremstilling av celler som skal frosne:

Før du fryser cellene, velger du celler med god vekststatus og i den logaritmiske vekstfasen og erstatter dem med friskt medium 12-24 timer før frysing for å opprettholde celletilstanden.

2. Eksperimentell prosedyre

1. Følg tettheten til cellene som skal frosne, som er omtrent 80%~ 90%. Bruk en pipettepistol for å aspirere det gamle mediet, tilsett sterile PBS for å vaske cellene 1-2 ganger, og fjern det gjenværende mediet i kulturmiljøet.

2. Tilsett en passende mengde trypsin eller fordøyelsessaft for å la trypsinet komme inn i cellene, og plasser dem i inkubatoren for fordøyelse. Observer tilstanden til cellene under mikroskopet: cytoplasmaet trekker seg tilbake og cellene er ikke lenger koblet til ark. På dette tidspunktet, legg til stoppløsningen for å stoppe fordøyelsesprosessen.

3. Boble forsiktig cellene med et spiss for å danne en cellesuspensjon og sentrifuge cellesuspensjonen ved 1000 o / min i 3-5 minutter.

Kast supernatanten, tilsett en passende mengde fryseløsning, og pipetten forsiktig for å få cellene til å telle jevnt. Juster celletettheten med kryokonserveringsmedium for å lage den endelige tettheten 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Bruk en pipettepistol for å skille kryogene rør i henhold til den forventede kapasiteten, og bruk en automatisk avdekkingsmaskin for å tette og forsegle.

5. Standard kryokonserveringsprogram er en avkjølingshastighet på -1 ° C til -2 ° C/min, og cellene som skal froses kan gradvis frosne i henhold til følgende trinn: romtemperatur → 4 ° C (20 minutter) → - 20 ° C (30 minutter) → -80 ° C ° C (over natten) → Langvarig lagring i flytende nitrogen.

Den kan også lagres direkte i en fryser ved -80 ° C over natten og deretter overføres til flytende nitrogen for lagring.

Yongyue Medical er et høyteknologisk foretak som spesialiserer seg på FoU, produksjon og salg av biomedisinske forbruksvarer. Pipettspisser, pipetter, PCR -plate, cellekulturprodukter og andre biologiske laboratorieforbruket. Yongyue Medical er verdig din tillit og valg! Velkommen til å konsultere!